Чт, 26.04.2018, 10:36
Приветствую Вас Гость | RSS

Гидролизат мидийный МИГИ К-ЛП


21:39
МЕТОДИКА АЭРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ПЫЛЬЦЫ РАСТЕНИЙ И СПОР ГРИБОВ ДЛЯ СОСТАВЛЕНИЯ КАЛЕНДАРЕЙ ПЫЛЕНИЯ
МЕТОДИКА АЭРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ПЫЛЬЦЫ РАСТЕНИЙ И СПОР ГРИБОВ ДЛЯ СОСТАВЛЕНИЯ КАЛЕНДАРЕЙ ПЫЛЕНИЯ
Инструкция по применению Учреждение-разработчик: Республиканский научно-практический центр гигиены Авторы: д-р мед. наук, проф. С.М. Соколов, канд. мед. наук Т.Е. Науменко, канд. биол. наук Т.Д. Гриценко, канд. геолого-минерал. наук В.П. Самодуров, канд. биол. наук В.Л. Шалабода, С.Т. Андрианова, Л.М. Шевчук, А.Е. Пшегрода 2 ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ Разработчики проекта «Европейская сеть по астме и аллергии» прогнозируют, что к 2015 году европейским странам грозит эпидемия аллергических заболеваний. Известно, что аллергические заболевания часто связаны с воздействием биологических и химических составляющих атмосферных аэрозолей. Важнейшими аллергенами аэрозолей являются пыльца растений и споры грибов, которые вызывают поллинозы. За последние 10 лет резко возрос практический интерес к бронхиальной астме и поллинозам . наблюдается рост заболеваемости при достаточном понимании природы болезни и обилии противоастматических и противоаллергенных лекарств. Установление причины поллиноза необходимо для правильного подбора диагностических и лечебных аллергенов, оптимальных сроков проведения специфической диагностики, профилактики и лечения. Начало заболеваний обычно совпадает по времени с цветением растений, являющихся аллергенами для человека, и симптомы, как правило, повторяются ежегодно в одно и то же время. Аллергенная обстановка определяется не самим фактом цветения трав и деревьев, а количественным содержанием зерен пыльцы в 1 м3 воздуха в течение 24 часов. Постоянные аэропалинологические исследования необходимы для разработки системы оповещения населения и медицинских учреждений о концентрации пыльцы и спор в 1 м3 воздуха («пыльцевом дожде») для оценки аллергенной обстановки, что позволит людям, страдающим аллергией, избежать или снизить тяжесть течения болезни. Решение этих вопросов связано с проблемой мониторинга аэропалинологического состояния атмосферы, с развитием постоянно действующей сети станций слежения за качественным и количественным составом пыльцевого дождя. Начало создания такой сети станций в Европе было положено в 70-х годах, а в конце 80-х аэропалинологи большинства европейских стран объединились для разработки единой программы исследований, создания международной службы и единого банка аэропалинологических данных. Общеевропейский банк аэропалинологических данных объединяет информацию более 100 3 национальных станций аэропалинологического мониторинга из большинства европейских стран. Начиная с 1993 года, банк данных предоставляет информацию о пылении разных растений на территории Европы и разрабатывает прогнозы пыления на основе текущих и многолетних аэропалинологических наблюдений и метеорологических данных. В нашей стране подобной аэропалинологической службы до настоящего времени не существует. Одним из важнейших моментов налаживания аэропалинологического мониторинга является разработка нормативно- методической базы проведения исследований. Инструкция «Методика аэробиологических исследований пыльцы растений и спор грибов для составления календарей пыления» разрабатывается впервые и является обобщающим документом ранее проведенных исследований. На ее базе будут созданы основные положения ведения мониторинга пыльцы растений и спор грибов в составе аэрозолей, градация содержания пыльцевых зерен и спор грибов и система информирования населения об опасных ситуациях в отношении .пыльцевого дождя. на примере города Минска. Инструкция предназначена для осуществления аэропалинологических наблюдений и на первом этапе будет использоваться Республиканским научно- практическим центром гигиены и Институтом геохимии и геофизики Национальной академии наук Беларуси. В задачи аэропалинологических исследований входит, в первую очередь, наблюдение за качественным и количественным составом пыльцевого дождя, выявление сезонной и суточной динамики пыления таксонов, изучение факторов, влияющих на формирование спорово-пыльцевых спектров, и составление прогноза пыления. Аналитическая процедура по исследованию включает сбор пыльцы растений и спор грибов, содержащихся в воздухе, их идентификацию, количественное определение при визуальном подсчете в поле зрения оптического или (и) электронного микроскопа и разработку Календарей пыления. 4 ТЕРМИНЫИОПРЕДЕЛЕНИЯАэропалинология. область современной биологии, изучающая состав и закономерности формирования пыльцевого дождя. Гравиметрическаяловушка. осаждение частиц происходит под действием силы тяжести. Импакторнаяловушка. частицы перемещаются с потоком воздуха и сталкиваются с поверхностью. Бывают 2 видов: естественные (частицы перемещаются ветром) и волюметрические (принудительно прокачивается воздух с заданной скоростью) Поллиноз. аллергическое заболевание, вызываемое пыльцой растений, проявляющееся клинически в виде сезонного аллергического ринита, конъюнктивита и иногда сопровождающееся развитием бронхиальной астмы и другими симптомами. Пыльцевойдождь. совокупность пыльцы растений и спор грибов, циркулирующих в атмосфере. РМ(Particulate Matter) . международное обозначение мелкодисперстных частиц аэрозолей. Индекс в нижней части обозначает размер в микронах (РМ2,5, РМ10). Таксон(биол.) . термин применяется для обозначения систематических единиц любого ранга, принят на Международном ботаническом конгрессе в 1950 г. (ед.ч. taxon, мн.ч. taxa). Транссекта. пересекающая 2ялиния (в данном случае, линия, пересекающая препарат вдоль . продольная транссекта, линия пересекающая препарат поперек . поперечная транссекта) Эталонныйпрепаратпыльцы. пыльца растения, определенная специалистом и приготовленная для длительного хранения, многократного просмотра в микроскопе и сравнения с изучаемым материалом. Используется в качестве наглядного пособия для обучения специалиста . палинолога. 5 Эффективностьловушки- отношение числа захваченных пылинок к общему числу пылинок, сброшенных в щель. ПРИБОРНОЕОБЕСПЕЧЕНИЕАЭРОБИОЛОГИЧЕСКИХИССЛЕДОВАНИЙВ настоящее время не существует универсальных ловушек, пригодных для исследования всех типов биологических частиц. Каждая область исследований (палинология, микология, вирусология и т.п.) требует своих методов отбора образцов, последующей обработки и идентификации материала. В основном используются два принципа улавливания биологических частиц: с помощью гравитации . гравитационные (взвешенные в воздухе частицы осаждаются под действием силы тяжести на горизонтальную поверхность) и импакторные (Impaction . столкновение) . взвешенные в воздухе частицы движутся вместе с потоком воздуха и осаждаются на поверхности различных типов и ориентации. Они, в свою очередь, бывают естественными (ветер) или искусственно созданными (различные насосы). Большинство импакторных ловушек относится к волюметрическому типу, поток воздуха в них создается принудительно, за счет работы воздушной помпы. В странах СНГ ловушки пыльцы не выпускаются. Американские и канадские исследователи пользуются в основном ловушками, произведенными в исследовательских центрах США; в Европе используют ловушки фирм Burkard (Англия) и Lanzoni (Италия), при явном преобладании пыльцеуловителей фирмы Burkard. Это довольно дорогостоящие приборы, и на оформление их покупки уходит много времени. При этом конструкция пыльцеуловителя относительно проста и воспроизводима. Поэтому одной из задач налаживания исследований явилась разработка и апробирование опытной модели пыльцеуловителя для анализа аэрозолей в условиях Беларуси. Для построения пыльцеуловителя, адаптированного к условиям города Минска, была выбрана схема ловушки Буркарда. Преимущество ловушки этого 6 типа состоит в том, что это impact-волюметрическая ловушка с прокачкой воздуха, удобным обслуживанием, подготовкой проб к анализу в микроскопе и хранению препаратов. Разработка пыльцеуловителя Буркарда включает следующие этапы: - проведение обзора конструкций ловушек различного типа; - обоснование выбора оптимальных параметров конструкции; - составление технической документация для выполнения опытной модели пыльцеуловителя; - конструирование и построение опытного экземпляра ловушки; - проведение апробирования и градуировки прибора (анализ РМ и пыльцы). На рис. 1 показана принципиальная схема ловушки Буркарда аналогичная образцам, представленным в справочниках [1, 2]. Оптимальные требуемые параметры при конструировании ловушки Буркарда: - входная щель 2 х 14 мм; - скорость прокачки воздуха 10 л/мин; - сбор пыльцы на прозрачную ленту Melinex tape; - скорость вращения барабана от 1 суток до 1 недели или 2 мм/час; - длина ленты на барабане 48 мм. Рис. 1. Схема ловушки 7 Принципиальная схема такова: корпус ловушки выполняют из пластика, крышка закрепляется герметически и весь поток воздуха идет через входное отверстие. Прокачка воздуха осуществляется вентилятором. Внутри расположен барабан, на поверхность которого прикреплена прозрачная лента с липким слоем. Барабан вращается с постоянной скоростью. Известно, что средний объем воздуха, потребляемого при дыхании, составляет 10 л/мин, и волюметрический пыльцеуловитель должен быть отрегулирован и приведен к этой величине. Часовой механизм, вмонтированный в ловушку, имеет ход со скоростью 1 оборот в неделю так, чтобы один замер составлял 7 сут сбора пыльцы, при сборке использован стандартный часовой механизм МЧН (механизм часовой недельный), применяемый в термографах и барографах с недельным циклом наблюдений. Скорость вращения 1,75 мм/час Рис. 2. Пыльцеуловитель. Слева . ловушка в сборе, в центре . крышка ловушки снята для смены ленты, справа . часовой механизм На рисунке 2 представлен опытный образец пыльцеуловителя, постройка которого была выполнена на базе Института геохимии и геофизики НАНБ. Апробация пыльцеуловителя проводилась с использованием пыльцы сосны и злаков. ОПРЕДЕЛЕНИЕЭФФЕКТИВНОСТИПЫЛЬЦЕУЛОВИТЕЛЯПыльцеуловитель является физическим прибором для определения концентрации пыльцы в 1 м3 воздуха. В идеальном случае все пылинки, проходя в приемную щель прибора, должны прилипнуть на клеящую 8 поверхность приемного барабана. На практике, однако, не вся пыльца захватывается прибором. Часть ее пролетает сквозь прибор и не фиксируется. Эффективность пыльцеуловителя является параметром, который показывает, какой процент пыльцы фиксируется ловушкой. Эффективность ловушки зависит от многих параметров: конфигурации щели, скорости прокачки воздуха, клеящей среды приемного барабана. Определение эффективности ловушки проводится путем вылавливания отдельных пылинок из массового пыльцевого препарата с помощью препаровальной иглы. С помощью этой иглы 100 пылинок сбрасывают во входную щель ловушки, работающей в стандартных условиях. Работа ведется с помощью двух бинокулярных линз. Одна линза используется для отбора отдельных пылинок из массового препарата, а вторая . для сбрасывания пылинок в щель прибора. После сбрасывания 100 пылинок в приемную щель прибора, фиксирующая клеящая лента достается из прибора, и проводится подсчет пылинок, захваченных прибором. Отношение числа захваченных пылинок к общему числу пылинок, сброшенных в щель, показывает эффективность ловушки. Для определения эффективности прибора используется известная и широко распространенная пыльца (например, сосны). Эффективность пыльцеуловителя является достаточно высокой в том случае, если после сброса 100 пылинок в щель прибора на фиксирующей ленте ловушки обнаружены свыше восьмидесяти пылинок. Так, если на фиксирующей ленте ловушки обнаружено 83 пылинки, то эффективность пыльцеуловителя составляет 83%. УСТАНОВКАПЫЛЬЦЕВОЙЛОВУШКИВысота установки пыльцеуловителя имеет первостепенное значение для выявления состава пыльцевого дождя. В большинстве случаев пыльцевые ловушки устанавливаются на высоте 10-20 м над уровнем земли, как правило, на крыше зданий. Состав пыльцевого спектра на уровне земли или на уровне человеческого роста (~ 1,5 м) отличается от состава спектра на больших 9 высотах в первую очередь повышенным содержанием пыльцы травянистых растений. Так, концентрация пыльцы полыни на уровне человеческого роста в 11,5 раз превышает содержание пыльцы полыни на высоте 15 м, злаков в 4,4 раза, соответственно. Для пыльцы деревьев столь значимая разница концентраций не отмечается . содержание пыльцы березы, ольхи, тополя, дуба, сосны, ивы на уровне человеческого роста лишь в 1,5, редко в 2 раза превышает концентрацию пыльцы этих таксонов на больших высотах. Мониторинг аэропалинологического состояния атмосферы на высоте человеческого роста дает и более точную информацию о начале пыления травянистых растений. Так, появление отдельных пыльцевых зерен полыни и злаков регистрируется на уровне земли на 1-2 недели раньше, чем на высоте 15 м [3]. В медицинских целях слежение за составом пыльцевого спектра необходимо проводить на двух уровнях: на высоте 10-20 м . для получения общей региональной динамики пыльцевого дождя и на уровне человеческого роста . для уточнения начала пыления и определения периода, опасного с аллергенной точки зрения. В стандартных аэропалинологических исследованиях пыльцевые ловушки устанавливают на высоте 10-20 м над уровнем земли на крыше зданий вдали от стен и других укрытий. Следует избегать также близости парков, ботанических садов и крупных промышленных предприятий. Во всех аэропалинологических работах высота установки ловушки должна быть оговорена. ПОДГОТОВКАСРЕДДЛЯУЛАВЛИВАНИЯЧАСТИЦУлавливающая поверхность в пыльцеуловителе Буркарда представляет собой предметное стекло или прозрачную ленту шириной 14 мм («Melinex tape» . тонкая не клейкая лента), поверхность которых покрыта смесью вазелина и воска (18 г вазелина и 2 г воска). Состав смесей и методы их приготовления цитируются по методическим указаниям .Принципы и методы аэропалинологических исследований.[2]. Приготовлениесмеси№1 (дляленты«Melinex tape») 10 1. Очищенный от пыльцы воск поместить в фильтровальную воронку с бумажным фильтром. 2. Воронку поместить на небольшой термостойкий химический стакан. 3. Стакан с воронкой поставить в муфельный шкаф и греть при температуре 60 оС, очищенный воск фильтруется в стакан и скапливается на дне. 4. Разогреть 18 г вазелина, поставить на аналитические весы и добавить 2 г жидкого воска. 5. Все аккуратно размешать и остудить при комнатной температуре. Смесь готова к употреблению. Работаслентой«Melinex tape» Для того, чтобы на барабан пыльцеуловителя прикрепить ленту «Melinex tape» используется любая лента с двухсторонней клейкой поверхностью, которая приклеивается к барабану узкими поперечными полосками в начале каждого суточного деления. Поверх нее на барабан пыльцеуловителя по окружности наклеивают ленту «Melinex tape». Для нанесения смеси воска и вазелина на ленту используют колонковую кисточку (ширина кисточки равна или превышает ширину ленты). Барабан пыльцеуловителя и саму смесь слегка разогревают. Вращая барабан, кисточкой наносят смесь, не допуская повторного смазывания. Барабан готов к работе и устанавливается в пыльцеуловитель. За неимением ленты «Melinex tape» и других лент шириной 14 мм разработана методика использования заменяющей ленты. Можно использовать одностороннюю клеящуюся ленту шириной 15 мм (желательно применение ленты шире отверстия ловушки от 15 мм до 20 мм). Лента крепится на барабане ловушки при помощи подогнутых краев. В качестве среды для изготовления препаратов следует использовать глицериножелатиновую смесь, которую готовят по следующему рецепту: 11 Приготовлениесмеси№2 (длялентысодностороннейклеящейсяповерхностьюиленты«Melinex tape») Потребуется: глицерин - 70 мл; желатин - 10 г; дистиллированная вода - 60 мл; фенол (для подавления роста грибов) - 0,1 г; фуксин или сафранин. 1. Желатин замачивают в дистиллированной воде до набухания. 2. На небольшом огне разогревают смесь до полного растворения желатина. 3. В горячую смесь добавляют глицерин и фенол. 4. Смесь разделяют на две части (2 а, 2 б). 5. Смесь 2 а хранят отдельно от смеси 2 б. 6. В смесь 2 б добавляют фуксин или сафранин. Присутствующий в среде краситель (фуксин или сафранин) окрашивает все живые пыльцевые зерна в красный цвет разной интенсивности, облегчая обнаружение и подсчет пыльцы в препарате. Насыщенность цвета и оттенок его окраски могут служить в некоторых случаях и диагностическими признаками. РаботасодностороннейклейкойлентойНа барабан пыльцеуловителя наклеивают ленту с односторонней клейкой поверхностью наружу. На эту поверхность наносят смесь № 2 б. Для нанесения смеси на ленту используют колонковую кисточку. Перед нанесением смесь № 2 б слегка разогревают вместе с кисточкой. Вращая барабан, кисточкой наносят смесь, повторное смазывание допускается. Закрашивающие движения производят по всей поверхности ленты с захватом краевых участков, что позволят одновременно приклеить ленту. При остывании смеси барабан готов к работе и устанавливается в пыльцеуловитель. После окончания одного цикла работы как экспериментальной, так и стандартной ловушки и смены барабана, вся лента разрезается лезвием на участки, каждый из которых соответствует одним суткам работы ловушки. Если пыльцеуловитель отрегулирован на работу в течение одной недели, то длина такого участка составит 42 мм в экспериментальной ловушке (48 мм в стандартной ловушке фирмы «Буркард»). 12 Каждый кусочек ленты наклеивается на предметное стекло. Для наклеивания как стандартной, так и экспериментальной ленты используется смесь № 2 а. Для этого разогретая смесь наносится кисточкой на предметное стекло, поверх нее укладывается пленка образцом кверху (клейкой стороной) таким образом, чтобы не образовались воздушные пузырьки. Рекомендуемыйспособ: пинцетом придерживают за тот край, который по времени соответствует ночному экспонированию, и противоположный короткий край медленно опускают на предметное стекло. Визуально контролируют наличие воздушных пузырьков. Если они появляются, образец приподнимают и повторяют наклеивание. Сверху образец покрывается тонким покровным стеклом, на нижнюю поверхность которого наносится кисточкой тонкий слой смеси № 2 б (т.е. поверхность, смазанная смесью, должна укладываться на поверхность образца «лицом к лицу»). При этом не допускать образования воздушных пузырьков. Образец снабжается этикеткой. Этикетка наклеивается на предметное стекло справа от образца. На этикетке указывается дата и временной интервал, соответствующий данному участку ленты. Например: 24.03.25.03.2005, 9.00. 9.00. Подготовленный так образец готов к просмотру и длительному хранению. ОПРЕДЕЛЕНИЕПЫЛЬЦЕВЫХЗЕРЕНИСПОРГРИБОВДля определения и идентификации пыльцы растений и спор грибов применяются следующие пособия-определители: 1. Бобров А.Е., Куприянова Л.А., Литвинцева М.В., Тарасевич В.Ф. Споры папоротникообразных и пыльца голосеменных и однодольных растений флоры европейской части СССР. - Л., 1983. - 208 c. 2. Bucher E., Kofter V., Vorwohl G., Zieger E. Das Pollen der Südtiroler Honige. - Stuttgart, 2004. - 678 S. 3. Куприянова Л.А. Палинология сережкоцветных. . М.; Л., 1965. - 216 c. 13 4. Куприянова Л.А., Алешина Л.А. Пыльца и споры растений флоры европейской части СССР. - Л., 1972. - Т.1. - 172 c. 5. Куприянова Л.А., Алешина Л.А. Пыльца и споры растений флоры европейской части СССР. - Л., 1978. - Т.2. - 184 c. 6. Каратыгин И.В., Азбукина З.М. Семейство устилаговые // Определитель грибов СССР. Порядок Головневые. - Л., 1989. - Вып.1. - 290 c. 7. Новожилов Ю.К. Класс Миксомицеты // Определитель грибов России. Отдел слизевики. - СПб., 1993. - Вып.1. - 288 c. 8. Winkler H., Ostrowski R., Wilhelm M. Pollenbestimmungsbuch der Stiftung Deuscher Polleninformationsdienst. - Paderborn, 2001. - 80 S. Также можно использовать базы данных «PalDat» и «ARMRU». ПОДСЧЕТПЫЛЬЦЕВЫХЗЕРЕНИСПОРГРИБОВВПРЕПАРАТЕПодсчет пыльцы проводится с применением микроскопа [2]. В качестве рабочего журнала используется общая тетрадь высотой 30 см с линейной или клеточной разлинейкой. Заполнение страниц выполняется вручную простым карандашом. На рисунке 3 представлен макет страницы рабочего журнала. В строке «№ образца» ставится тот номер образца, под которым он будет храниться в исследовательской лаборатории. В строке «Заполнено» ставится дата экспонирования образца и время суток (если несколько измерений в сутки). Фамилия исследователя пишется в том случае, если журналом пользуются несколько человек. В столбце «№» ставится порядковый номер таксона по мере регистрации. № образца _______ Заполнено .___._______________ время _______ _______________________ число месяц год время суток Ф. И.О. исследователя № Наименование таксона Подсчет количества Сумма Явление 1 Alnus IIIIIIIIIIIIIIIIIIII 20 дождь 2 Corylus IIIIIIIIIIIIIIII 16 3 Populus IIIIIIIIIII 11 4 ..... 14 5 ..... 6 Древесные 47 Травы -- Споры -- ИТОГО Сумма 47 Рис. 3. МакетстраницырабочегожурналаВ столбце «Наименование таксона» пишется латинское имя таксона (это международная норма для палинологов): - вид, если определение выполнено до вида; - род, если определение выполнено до рода; - семейство, если определено только семейство; - морфологическая группа спор (для спор грибов, если другие определения невозможны). Заготовка с названиями, выполненными заранее, неприемлема, так как в разные дни регистрируется пыльца разных таксонов по мере появления в воздухе. Столбец «Подсчет количества» заполняется исследователями по своему усмотрению. Для кого-то удобнее ставить палочки, кто-то пишет цифры. Наиболее удобным, на наш взгляд, является подсчет количества в виде зачеркнутых квадратов. Вначале ставятся угловые точки квадрата (их 4), затем они соединяются линиями (еще 4) и перечеркиваются перекрестными линиями (их 2), таким образом, получается 10 . Столбец «Сумма» показывает суммарное содержание пыльцы или спор по каждому таксону. Столбец «Явление» позволяет отмечать погодные и иные условия, которые '84・ могут влиять на количество пыльцы и спор (дождь, туман, появление пуха, сильная задымленность и т.п.). После подсчета образца заполняется итоговая колонка «ИТОГО», подсчет пыльцы и спор производится по растительным группам «Древесные», «Травы», «Споры». 15 В строку «Сумма» заносится итоговая сумма всех подсчитанных таксонов по растительным группам. Для оценки содержания пыльцевых зерен в воздухе необходимо проанализировать не менее 20% от общей площади препарата. Существует несколько способов подсчета пыльцевых зерен в образце: 1. Отдельными полями зрения, хаотично расположенными по всей площади препарата, их должно быть не менее 500. 2. Непрерывными транссектами, параллельными продольной оси препарата и расположенными регулярно (4 транссекты). 3. непрерывными транссектами, перпендикулярными продольной оси препарата и расположенными регулярно (12 транссект). Последний (№ 3) способ, наряду с анализом суммарного содержания пыльцы в воздухе, дает возможность оценить и суточную ритмику пыления отдельных растений. Так, анализируя препарат 12 перпендикулярными
транссектами, расположенными
Просмотров: 2341 | Добавил: koiot | Рейтинг: 0.0/0
Всего комментариев: 0
avatar
Корзина
Ваша корзина пуста
Категории раздела
Вход на сайт
Поиск
Календарь
«  Июль 2010  »
ПнВтСрЧтПтСбВс
   1234
567891011
12131415161718
19202122232425
262728293031
Наш опрос
Какие изменения произошли после приема МИГИ-К ЛП?
Всего ответов: 15388
Статистика

Онлайн всего: 1
Гостей: 1
Пользователей: 0